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NASBA法の原理について

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NASBA初期行程

(1) 鋳型となるRNAに、プライマー1(P1)が結合します。P1の5'末端には、T7 RNA polymeraseのプロモーター配列が付加されています。
(2) AMV Reverse Transcriptase(AMV-RT)によってcDNAが合成されます。
(3) RNA-DNA(2本鎖)ハイブリッドになりました。
(4) RNase Hによって、RNA-DNA(2本鎖)ハイブリッドのRNA鎖だけが分解され、1本鎖cDNAになります。
(5) cDNAに、プライマー2(P2)が結合します。
(6) AMV-RTのDNA polymerase 活性によって、プロモーター配列の付加された2本鎖cDNAが合成されます。

NASBA増幅行程

(7) 2本鎖のプロモーター配列をT7 RNA polymeraseが認識して、P2の5'末端までT7 RNA polymeraseによる転写反応で、1本鎖のアンチセンスRNAが多数合成されます。
(8) (7)の工程で合成された1本鎖のアンチセンスRNAに、P2が結合します。
(9) AMV-RTによってcDNAが合成されます。
(10) RNA-DNA(2本鎖)ハイブリッドになりました。
(11) RNase Hによって、RNA-DNA(2本鎖)ハイブリッドのRNA鎖だけが分解され、1本鎖cDNAになります。
(12) cDNAに、P1が結合します。
(13) AMV-RTのDNA polymerase 活性によって、プロモーター配列の付加された2本鎖cDNAが合成されます。
(14) (7)の工程と同様に、T7 RNA polymeraseによる転写反応で、1本鎖のアンチセンスRNAが合成されます。
(15) 合成されたアンチセンスRNAを鋳型にして、(7)および(8)~(14)のサイクルを繰り返し、アンチセンスRNAが大量に増幅されます。