NASBA Amplification キット

特徴

低温増幅反応（41℃）
RNAを特異的に増幅
高感度（2-10　コピー）
高効率（＞109-10 in 90 min）
高正確（High fidelity: ＞99.7 %)
簡易検出（増幅産物：1本鎖 RNA）
遺伝子発現量解析に有用

NASBA法の原理

プライマー：2種類
酵素：3種類（AMV-RT、RNaseH、T7RNAP)
増幅産物：アンチセンスRNA

NASBA法での増幅過程

試薬構成

プライマーを除く、NASBA増幅用試薬セット
高安定性：ヌクレオチド、酵素類が凍結乾燥品
研究用試薬
試薬構成：3試薬，各10本（5回×10）
- NASBA試薬：‥‥dNTPs，NTPs（凍結乾燥品）
- NASBA溶解液：‥‥トリス緩衝液，DMSO（溶液）
- NASBA酵素試薬：‥‥AMV-RT，RNaseH，T7 RNA polymerase（凍結乾燥品）

用語解説

AMV Reverse Transcriptase

Reverse transcriptase (RT) は、DNA polymerase の一種で RNA依存性DNA polymerase活性及びDNA依存性DNA polymerase活性を持つ酵素である。即ち、一本鎖のDNAまたはRNAを鋳型とし、5’→ 3’方向に相補的なDNAを合成する。プライマーは RNA、DNA共に使用可能である。この酵素はRNase H活性を併せ持つ。AMVとはAvian myeloblastosis virusのことであり、本酵素は AMVから精製されている。

RNase H

RNase Hは、DNAとRNAのハイブリットRNAのみを分解するRNA分解酵素である。1本鎖 RNA は分解されない。酵素活性には2価のイオンが必須であり、RNAのホスホジエステル結合を解裂して5’-リン酸末端と3’-OH末端を生成する。逆転写酵素にも活性が確認されている。本酵素の活性は広く生体内に同定され、DNA複製に関与すると推定されているが、詳細な生物学的役割は不明である。

T7 RNA polymarase

大腸菌ファージT7の遺伝子産物で、約20塩基対からなるファージ固有のプロモーター配列を認識するRNA polymerase。5’→3’RNA polymerase活性を持ち、T7プロモーター配列を含む2本鎖の DNAを鋳型に、NTPを基質としてプロモーター下流の鋳型DNAの相補的RNAを合成する。

使用方法

20μL定性NASBA反応

準備として必要な試薬および器具

試薬
1	プライマー（2種）標的RNAに相補的なオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー5’側にT7 RNA polymerase配列付加 5’-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG-3’
2	Nuclease-free water：NASBA酵素試薬溶解用

器具
1	0.5mL マイクロチューブ（RNase-free）
2	ヒートブロック(65℃, 41℃)
3	ピペットマン等
4	フィルターチップ
5	ボルテックスミキサー
6	卓上遠心器

測定プロトコール（20μL定性NASBA反応

1	NASBA溶解液へ2種類プライマー添加 (各0.4μM) 60μL	0.4μM×100μL／μM= μL プライマーストック液濃度
2	1)添加，NASBA試薬溶解（NASBA反応試薬調製）
3	2)NASBA反応試薬分注	10μL/本×5 本
4	検体（RNA溶液）添加	5μL/本
5	インキュベーション（変性）	65℃，5分
6	インキュベーション（アニーリング）	41℃，5分
7	6)インキュベーション中に酵素試薬溶解	30-55μL water/本
8	7)酵素試薬添加（*温度低下注意）	5μL/tube
9	インキュベーション（増幅反応）	41℃，90分
10	反応終了後，検出までNASBA産物保存	-20℃以下